ELISA實(shí)驗(yàn)中常見問題及主要原因可歸納如下：

　　一、顯色異常問題

　　顯色淡/靈敏度低?

　　主要原因：試劑未平衡至室溫、溫育溫度不足37℃、溫育時(shí)間不足、加樣量偏少、洗滌過度(沖擊力大/浸泡時(shí)間長)、底物作用時(shí)間不足、NaN3防腐劑抑制酶活性、蒸餾水污染等?。

　　典型表現(xiàn)：陽性對照值偏低，標(biāo)準(zhǔn)曲線梯度不明顯?。

　　高背景/假陽性?

　　主要原因：封閉不充分、底物污染、孵育時(shí)間過長、洗滌不凈、抗體非特異性結(jié)合、樣本中存在類風(fēng)濕因子等干擾物質(zhì)?。

　　典型表現(xiàn)：陰性對照孔OD值偏高?。

　　二、重復(fù)性差問題

　　復(fù)孔差異大?

　　主要原因：加樣量不一致、加樣時(shí)間不同步、移液器未校準(zhǔn)、洗滌條件或操作人員不一致、樣本未充分混勻?。

　　典型表現(xiàn)：同一樣本復(fù)孔間OD值波動顯著?。

　　三、標(biāo)準(zhǔn)曲線異常

　　線性不佳?

　　主要原因：標(biāo)準(zhǔn)品濃度不準(zhǔn)確、稀釋操作誤差、酶標(biāo)儀未校準(zhǔn)、抗體濃度不均?。

　　典型表現(xiàn)：R2值低或曲線非線性?。

　　無信號/信號弱?

　　主要原因：試劑過期、HRP酶失活、操作順序錯(cuò)誤(如生物素化抗體與酶結(jié)合物加樣顛倒)、不同批次試劑混用?。

　　四、其他常見問題

　　滿板白/陽性對照不顯色?：抗體或抗原過量、底物過量、酶標(biāo)記物失活?。

　　花板/跳孔?：移液器吸頭堵塞、加樣位置不準(zhǔn)確、樣本污染?。

　　樣本干擾?：溶血/脂血樣本未處理、保存不當(dāng)導(dǎo)致蛋白降解?。

　　關(guān)鍵預(yù)防措施

　　標(biāo)準(zhǔn)化操作?：嚴(yán)格按說明書控制加樣量、孵育時(shí)間(37℃±0.5℃)、洗滌次數(shù)(3-5次)?。

　　試劑管理?：避免不同批次混用，使用新鮮蒸餾水，平衡試劑至室溫?。

　　環(huán)境控制?：底物孵育避光，溫育過程減少開蓋?。

　　注意：以上僅供參考，不作為實(shí)際數(shù)據(jù)，實(shí)驗(yàn)需嚴(yán)格遵循說明或咨詢技術(shù)老師。 Elisa試劑盒

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